Время смерти: новые технологии, необходимые для большей точности

Для исследователей, изучающих нейродегенерацию, отсутствие точного объявления «времени смерти» для нейронов затрудняет определение факторов, приводящих к гибели клеток, и скрининг лекарств, которые могут спасти стареющие клетки от смерти.              

Теперь исследователи из Gladstone Institutes разработали новую технологию, которая позволяет им отслеживать тысячи клеток одновременно и определять точный момент смерти для любой клетки в группе. В статье, опубликованной в журнале Nature Communications, команда показала, что этот подход работает в клетках грызунов и человека, а также в живых рыбках данио и может использоваться для отслеживания клеток в течение периода от нескольких недель до месяцев.

«Точное время смерти очень важно для выяснения причин и следствий нейродегенеративных заболеваний», - говорит Стив Финкбейнер, доктор медицинских наук, директор Центра систем и терапии в Гладстоне и старший автор обоих новых исследований. «Это позволяет нам выяснить, какие факторы непосредственно вызывают гибель клеток, какие являются случайными, а какие могут быть механизмами преодоления, задерживающими смерть».

В сопроводительной статье, опубликованной в журнале Science Advances, исследователи объединили технологию клеточных сенсоров с подходом машинного обучения, обучая компьютер различать живые и мертвые клетки в 100 раз быстрее и точнее, чем у человека.

«Студентам колледжа потребовались месяцы, чтобы проанализировать такие данные вручную, а наша новая система работает почти мгновенно - она ​​работает быстрее, чем мы можем получить новые изображения на микроскопе», - говорит Джереми Линсли, доктор философии, руководитель научной программы в Finkbeiner. lab и первым автором обеих новых статей.

Как научить старый датчик новым трюкам

Когда клетки умирают - независимо от причины или механизма - они в конечном итоге становятся фрагментированными, а их мембраны дегенерируют. Но этот процесс деградации требует времени, из-за чего ученым трудно различать клетки, которые давно перестали функционировать, те, которые больны и умирают, и те, которые здоровы.

Исследователи обычно используют флуоресцентные метки или красители, чтобы проследить за больными клетками с помощью микроскопа с течением времени и попытаться диагностировать, где они находятся в этом процессе деградации. Многие индикаторные красители, красители и метки были разработаны для того, чтобы отличить уже мертвые клетки от тех, которые еще живы, но они часто работают только в течение коротких периодов времени, прежде чем исчезнут, а также могут быть токсичными для клеток при нанесении.

«Мы действительно хотели индикатор, который действовал бы в течение всего времени жизни клетки, а не только несколько часов, - а затем давал бы четкий сигнал только после определенного момента, когда клетка умирает», - говорит Линсли.

Линсли, Финкбейнер и их коллеги использовали датчики кальция, изначально разработанные для отслеживания уровня кальция в клетке. Когда клетка умирает и ее мембраны становятся негерметичными, одним из побочных эффектов является то, что кальций устремляется в водянистый цитозоль клетки, который обычно имеет относительно низкий уровень кальция.

Итак, Линсли сконструировал сенсоры кальция так, чтобы они располагались в цитозоле, где они флуоресцируют только тогда, когда уровень кальция повышается до уровня, указывающего на гибель клетки. Новые датчики, известные как генетически закодированный индикатор смерти (GEDI, произносится как джедаи в «Звездных войнах»), могут быть вставлены в любой тип клетки и сигнализируют о том, что клетка жива или мертва, в течение всего времени жизни клетки.

Чтобы проверить полезность обновленных сенсоров, группа поместила под микроскоп большие группы нейронов, каждая из которых содержит GEDI. После визуализации более миллиона клеток, в некоторых случаях склонных к нейродегенерации, а в других - подверженных воздействию токсичных соединений, исследователи обнаружили, что датчик GEDI был намного точнее других индикаторов гибели клеток: не было ни одного случая, когда датчик был активировалась, и клетка осталась жива. Более того, в дополнение к этой точности, GEDI, казалось, также обнаруживал гибель клеток на более ранней стадии, чем предыдущие методы - близко к «точке невозврата» для гибели клеток.

«Это позволяет разделять живые и мертвые клетки таким способом, который раньше был невозможен», - говорит Линсли.

Обнаружение сверхчеловеческой смерти

Линсли упомянул GEDI своему брату - Дрю Линсли, доктору философии, доценту Университета Брауна, который специализируется на применении искусственного интеллекта к крупномасштабным биологическим данным. Его брат предложил исследователям использовать датчик в сочетании с подходом машинного обучения, чтобы научить компьютерную систему распознавать живые и мертвые клетки мозга, основываясь только на форме клетки.

Команда объединила результаты нового датчика со стандартными данными флуоресценции на тех же нейронах и научила компьютерную модель, называемую BO-CNN, распознавать типичные паттерны флуоресценции, связанные с тем, как выглядят умирающие клетки. Модель, как показали братья Линсли, была точна на 96 процентов и лучше, чем то, что могут сделать люди-наблюдатели, и была более чем в 100 раз быстрее, чем предыдущие методы дифференциации живых и мертвых клеток.

«Для некоторых типов клеток человеку чрезвычайно сложно определить, жива ли клетка или мертва, но наша компьютерная модель, обучаясь у GEDI, смогла различить их на основе частей изображений, которые мы ранее не знали. помогли отличить живые и мертвые клетки », - говорит Джереми Линсли.

И GEDI, и BO-CNN теперь позволят исследователям проводить новые высокопроизводительные исследования, чтобы обнаружить, когда и где умирают клетки мозга, что является очень важной конечной точкой для некоторых из наиболее важных заболеваний. Они также могут проверять лекарства на их способность задерживать или предотвращать гибель клеток при нейродегенеративных заболеваниях. Или, в случае рака, они могут искать лекарства, которые ускоряют гибель больных клеток.

«Эти технологии меняют правила игры в нашей способности понять, где, когда и почему происходит смерть в клетках», - говорит Финкбайнер. «Впервые мы действительно можем использовать скорость и масштаб, обеспечиваемые достижениями в области роботизированной микроскопии, для более точного обнаружения гибели клеток и делать это задолго до момента смерти. Мы надеемся, что это может привести к более специфическим методам лечения многих нейродегенеративных заболеваний, которые до сих пор неизлечимы ».