Анализ публичных данных
Данные о линиях SARS-CoV-2 и дате взятия образца из последовательностей, доступных из Чили, были получены на сайте Consorcio Genomas CoV2, доступном по адресу: https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Данные о вакцинации были получены из общедоступных данных Министерства науки, технологий, знаний и инноваций, доступных по адресу: https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Продукт 83).
Анализ на инфекционность
Псевдотипированные вирусы, несущие различные шиповые белки SARS-CoV-2, были приготовлены, как мы описали ранее.12. Вкратце, псевдотипы SARS-CoV-1 на основе ВИЧ-2 были получены в клетках HEK293T путем трансфекции pNL4.3-ΔEnv-Luc вместе с соответствующим кодирующим вектором pCDNA-SARS-CoV-2 Spike в молярном соотношении 1:1. Плазмиды, кодирующие оптимизированный по кодонам спайк, в котором отсутствуют последние 19 аминокислот С-конца (SΔ19), которые, как известно, избегают удержания в эндоплазматическом ретикулуме.12 были получены путем синтеза генов или адаптированного сайт-направленного мутагенеза (GeneScript) и содержали следующие мутации: линия A (эталонной последовательности), линия B (D614G), линия B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), линия P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) и линия C.37 (G75V, T76I, Δ246) - 252, L452Q, F490S, D614G, T859N). Каждый препарат псевдотипа очищали центрифугированием при 3,000 об/мин при комнатной температуре, количественно определяли с использованием набора для иммуноферментного анализа ВИЧ-1 Gag p24 Quantikine (R&D Systems), аликвотировали в 50% фетальной бычьей сыворотке (Sigma-Aldrich) и хранили при -80°C до использовать. Различные количества псевдотипированных вирусов (определяемые по уровням белка p1 ВИЧ-24) использовали для заражения клеток HEK-ACE2, а через 48 часов активность люциферазы светлячков измеряли с использованием реагента для анализа люциферазы (Promega) в микропланшете Glomax 96. люминометр (Промега).
Анализ нейтрализации
Псевдотипированные анализы нейтрализации вируса проводились, по существу, так, как мы описали ранее.12. Вкратце, серийные разведения образцов плазмы (от 1:4 до 1:8748) готовили в DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой и инкубировали с 5 нг р24 каждого псевдотипированного вируса в течение 1 часа при 37°C, а затем 1×104 клеток HEK-ACE2 добавляли в каждую лунку. Клетки HEK293T (не экспрессирующие ACE2), инкубированные с псевдотипированным вирусом (линия А), использовали в качестве отрицательного контроля. Через 48 часов клетки лизировали и активность люциферазы светлячков измеряли с использованием реагента для анализа люциферазы (Promega) в люминометре Glomax 96 Microplate (Promega). Процент нейтрализации для каждого разведения рассчитывали, а ID50 каждого образца рассчитывали с использованием GraphPad Prism версии 9.0.1.
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 9.1.2. Множественные групповые сравнения титров нейтрализующих антител (NAbT) против панели псевдотипированных вирусов SARS-CoV-2, а также сравнения ответов NAbs в зависимости от пола и статуса курения были проведены с использованием парного знаково-рангового критерия Вилкоксона. Изменение фактора рассчитывали как разницу среднего геометрического титра в ID50 по сравнению с таковым у псевдотипированного вируса дикого типа. Корреляционный анализ между NAbT и возрастом или ИМТ проводился с использованием теста Спирмена. Для статистического анализа инфекционности проводили однофакторный дисперсионный анализ и тест множественного сравнения Тьюки. Значение p<0.05 считалось статистически значимым.
Этическое одобрение
Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике медицинского факультета Чилийского университета (проекты № 0361-2021 и № 096-2020) и клиники Санта-Мария (проект № 132604-21). Все доноры подписали информированное согласие, а их образцы были анонимизированы.
Влияние спайковых мутаций в варианте лямбда на инфекционность и нейтрализующие ответы антител
Анализ 3695 последовательностей из Чили, депонированных в GISAID по состоянию на 24 июня.th 2021 год демонстрирует явное доминирование вариантов SARS-CoV-2 Gamma и Lambda в течение последнего триместра, на которые в совокупности приходится 79% всех последовательностей.
Интересно, что этот период характеризовался массовой кампанией вакцинации, в ходе которой 65.6% целевой группы населения (лица 18 лет и старше) получили полную схему вакцинации по состоянию на 27 июня.th 2021
Учитывая, что 78.2% людей, привитых по полной схеме, получили инактивированную вирусную вакцину CoronaVac от Sinovac Biotech, мы попытались изучить влияние шиповых мутаций, присутствующих в варианте Lambda, на нейтрализующую способность антител, вызываемых этой вакциной.
Для этого мы создали псевдотипированные вирусы SARS-CoV-1 на основе ВИЧ-2, несущие шиповидный белок из эталонной линии Wuhan-1 (дикий тип; линия A), мутацию D614G (линия B) и альфа (линия B). .1.1.7), варианты Гамма (линия P.1) и Лямбда (линия C.37).
Во время приготовления вируса мы последовательно наблюдали, что клетки, инфицированные псевдотипированным вирусом, несущим лямбда-шип, производят значительно более высокие значения биолюминесценции по сравнению с мутантом D614G или вариантами Альфа и Гамма, что указывает на повышенную инфекционность, обусловленную белком лямбда-шипа.
Рисунок 1.Инфекционность, опосредованная различными шиповидными белками.
(A) Схематическое изображение шиповидного белка SARS-CoV-2 и вариантов, использованных в этом исследовании. Родословная указана в скобках. RBD — рецептор-связывающий домен, CM; цитоплазматический хвост.
(B) Титрование псевдотипов каждой линии с использованием эквивалентных количеств p1 ВИЧ-24. Активность люциферазы светлячков измеряли в относительных единицах люминесценции (RLU) через 48 часов после заражения. Среднее значение и стандартное отклонение были рассчитаны на основе репрезентативного трехкратного эксперимента.
Затем мы использовали псевдотипированные вирусы, упомянутые выше, для проведения анализов нейтрализации с использованием 79 образцов плазмы здоровых медицинских работников из Университета Чили и Клиники Санта-Мария в Сантьяго, Чили.
Мы исключили 4 образца, поскольку не смогли рассчитать титр ID50. Из проанализированных образцов 73% соответствовали женщинам, средний возраст которых составлял 34 года (IQR 29–43) и индексом максимального тела (ИМТ) 25 (IQR 22.7–27). 20.5% участников заявили, что являются активными курильщиками во время периода иммунизации. Образцы были получены в среднем через 95 дней (IQR 76–96) после второй дозы вакцины CoronaVac.
Мы наблюдали, что нейтрализация псевдотипированного вируса, несущего шиповый белок дикого типа, привела к 50% ингибирующему разведению (ID50) средний титр 191.46 (154.9 – 227.95, 95% ДИ), тогда как был 153.92 (115.68 – 192.16, 95% ДИ), 124.73 (86.2 – 163.2, 95% ДИ), 104.57 (75.02 – 134.11, 95% КИ ) и 78.75 (49.8–107.6, 95% ДИ) для псевдотипированных вирусов, несущих шиповый белок из мутанта D614G или вариантов Альфа, Гамма и Лямбда соответственно.
Мы также заметили, что средний геометрический титр ID50 титры снизились в 3.05 раза (2.57 – 3.61, 95% ДИ) для псевдотипированного вируса, несущего лямбда-спайк, в 2.33 (1.95 – 2.80, 95% ДИ) для гамма-спайка – в 2.03 (1.71 – 2.41, 95% ДИ) для шипа Alpha и 1.37 (1.20–1.55, 95% ДИ) для шипа D614G по сравнению с шипом типа Wild.
В нашей исследовательской когорте не наблюдалось корреляции между полом, возрастом, индексом массы тела (ИМТ) или статусом курения и титрами нейтрализующих антител.
Рисунок 2.Анализ нейтрализации с использованием образцов плазмы от вакцинированных CoronaVac
(A) Изменения реципрокного 50%-го титра нейтрализации (ID50) в образцах плазмы 75 реципиентов вакцины CoronaVac против D614G (линия B), Альфа (линия B.1.1.7),
Варианты гамма (линия P.1) и лямбда (линия C.37) по сравнению с вирусом дикого типа. Результаты представлены как разница титров нейтрализации соответствующих образцов. Значения P для сравнения идентификатора50 рассчитываются с помощью знаково-рангового критерия Уилкоксона.
(B) Ящиками показаны медиана и интерквартильный размах (IQR) ID.50 для каждого псевдотипированного вируса. Изменения факторов показаны как разница средних геометрических титров в ID.50 по сравнению с таковыми для псевдотипированного вируса дикого типа. Статистический анализ проводился с использованием знаково-рангового критерия сопоставленных пар Уилкоксона.
В совокупности наши данные показали, что шиповый белок недавно обнаруженного представляющего интерес варианта Lambda, широко циркулирующего в Чили и странах Южной Америки, несет мутации, обеспечивающие повышенную инфекционность и способность ускользать от нейтрализующих антител, вызываемых CoronaVac.
